將32 P標記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5分鐘，迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應蓋嚴，以防液體蒸發。
雜交結束后，去除雜交液，立即于室溫把濾膜放入大體積（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中，輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至少翻轉一次。重復洗 一次，同時應避免膜干涸。
68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次，每次1-1.5小時。此時已可進行自顯影。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件，可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。
DNA 探針為原位雜交提供較高的靈敏度。與RNA探針相比，DNA探針與靶mRNA 分子的雜交強度較弱，因此在雜交后的洗滌中不應使用甲醛。
探針特異性至關重要。如果已知細胞中mRNA或DNA的確切核苷酸序列，則可據此設計高度的互補探針。如果超過 5% 的堿基對不互補，那么探針只能與靶序列發生輕度雜交。這意味著，探針更容易在洗滌和檢測步驟中被洗去，可能無法正確檢測。
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